Описание возможностей инъекционного коллагена I типа. Эффекты применения ЕС-I на результатах экспериментов

Автор: Старкова Елена Юрьевна

Пластический хирург, председатель Европейской Школы Тредлифтинга, медицинский советник компании Beauty Expert, врач-дерматолог, врач-косметолог, тренер-методист международного класса, врач-исследователь Института инновационного развития и экспертизы в здравоохранении, член Ассоциации нитевых имплантологов, WOSIAM, RUSIAM, ISCAM, ОСЭМ, МООСБТ

Коллаген — самый распространенный белок в организме человека, который отвечает за структуру, стабильность и прочность, особенно в дермальных слоях. С возрастом увеличение деградации и ухудшение качества коллагенового волокна вместе со снижением его биосинтеза влечет изменение гомеостаза и соответствующие функциональные нарушения в деятельности разных типов коллаген-содержащей соединительной ткани: так происходит изменение ригидности стенок артерий, жесткости волокон кожи, уменьшение эластичности и проницаемости базальной мембраны и развитие других патологий. На сегодняшний день открыто более 20 генов, которые кодируют разные типы коллагена и тем самым определяют функциональное предназначение соответствующих тканей.

Для кожи процесс cтарения проявляется в виде хроно- и фотопроцессов, которые во многом связаны со структурными изменениями дермы. Это напрямую зависит от функциональной активности фибробластов, синтезирующих основные структурные компоненты ВКМ, в том числе, его главный строительный белок — коллаген. Фибробласты старой кожи имеют минимальную миграцию, снижение пролиферативного ответа, округлую форму и дефекты образования матрикса по сравнению с дермальными фибробластами молодых людей. Коллагеновые волокна в коже прежде всего выполняют опорную функцию. Сосочковый и сетчатый слои содержат коллаген разных типов. Интерстициальный фибриллярный коллаген типов I и III представляют собой самую большую фракцию этого белка и составляет 70% от массы дермы, при этом доля первого составляет до 85% от объема всей фракции. Коллаген — полиморфный белок, совокупно коллаген всех типов составляет треть всех белков организма. Такое широкое представительство объясняется тем, что наряду с опорной ролью он должен играть роль «посредника, несущего морфогенетическую информацию ДНК при построении органов из клеток» [1]. Это предположение подтверждается многочисленными исследованиями, свидетельствующими об улучшении условий роста различных клеток (фибробластов, клеток эпителия и эндотелия, макрофагов) на коллагеновых субстратах, также сообщалось о способности матрикса на основе коллагена поддерживать пролиферацию и миграцию клеток [3-6].

Коллаген I типа, наиболее используемый в медицине, считается эталонным стандартом из-за его высокой биосовместимости с человеческим организмом [7, 8]. Коллаген известен своим биологическим действием, низкой иммуногенностью и большим потенциалом в фармацевтической и клинической областях. Имеется большая доказательная база по поведению коллагенового каркаса in vitro. Однако прямое воздействие водной суспензии коллагена на культуры клеток еще мало изучено. По этой причине исследование, проведенное итальянскими учеными Francesca Lombardi et al. [2] в 2020 г. и о котором будет упомянуто ниже, представляет особый интерес для практикующих врачей. В работе исследовано применение микронизированной водной суспензии конского коллагена I типа (далее ЕС-I).

«Микронизация — это процесс, который уменьшает размер белковых агрегатов, улучшая скорость их растворения, при этом сохраняет структурную целостность белка [9,10]»

Эффекты применения ЕС-I были оценены на клеточной линии NIH 3T3 фибробластов эмбриона мыши Swiss. Микронизированный конский коллаген I типа (LINERASE, 100 мг порошка конского коллагена I типа) суспендировали в 5 мл (концентрация 20 мг/мл) и использовали в конечных концентрациях 0,4, 4 или 8 мг/мл. Одновременно оценивалось несколько эффектов.

С помощью спектрофотометрии определили способность ЕС-I влиять на жизнеспособность клеток NIH 3T3 и уровень внутриклеточного коллагена. Воздействие всех трех концентраций ЕС-I не показало различий в уровне апоптоза между контрольными клетками и клетками, обработанными ЕС-I (рис 1). Далее рассмотрели вопрос о содержании внутриклеточного коллагена: концентрации 4 и 8 мг/мл вызывали значительное повышение уровня коллагена либо через 24, либо через 48 часов, в то время как 0,4 мг/мл ЕС-I не влияли на содержание коллагена по сравнению с необработанными клетками (рис. 2). Поскольку 0,4 мг/мл не влияли на выработку коллагена, а обработка 4 и 8 мг/мл дала сопоставимые результаты, для последующих экспериментов использовали самую низкую эффективную концентрацию 4 мг/мл.

Влияние ЕС-I на продукцию коллагена I и III типов оценивали с помощью иммунофлуоресценции. После 24 часов инкубации с ЕС-I или без него (контрольная группа) клетки окрашивали на коллаген типа I (Col Ia1, зеленый) и типа III (Col IIIa1, зеленый) и на ядра (DAPI,синий). Как показано на рис. 3, клетки, обработанные ЕС-I, показали более интенсивное и широко распространенное окрашивание коллагена типов I и III по сравнению с необработанными клетками, что свидетельствует об увеличении синтеза коллагена. Авторы рассудили, что поскольку все клетки показывают 100% положительную реакцию как на коллаген I, так и на коллаген III, справедливо сделать вывод, что одна и та же клетка экспрессировала оба типа коллагена и что обработка ЕС-I привела к увеличению обоих коллагенов I и III во всех культивируемых клетках.

Синтез коллагена регулируется множеством посттрансляционных модификаций, которые происходят как во внутриклеточном, так и во внеклеточном пространстве [11]: внутриклеточные события включают посттрансляционное гидроксилирование и гликозилирование, ассоциацию полипептидных цепей и сворачивание тройной спирали; внеклеточные события включают расщепление N- и C- пропептидов, самосборку коллагена в фибриллы и сшивание фибрилл. Пролил-4-гидроксилаза — фермент, катализирующий гидроксилирование пролином проколлагена, необходим для созревания и синтеза коллагена в фибробластах. Молекулярный шаперон эндоплазматического ретикулума НSР47 действует на нескольких этапах созревания коллагена: предотвращает агрегацию и разложение вновь образованных цепей проколлагена, ускоряет образование трехспиральной структуры и стабилизирует ее, содействует секреции коллагена.

С учетом огромной роли упомянутых белков в производстве коллагена исследовали экспрессию этих двух важнейших белков биосинтеза, созревания и секреции коллагена — пролил-4-гидроксилазы (Р4Н) и белка теплового шока 47, также культивируя в течение 24 часов с ЕС-I в концентрации 4 мг/мл или без него. Результаты (данные взяты из трех независимых экспериментов в двух экземплярах, значения выражены как средние) денситометрического анализа показывают заметное и статистически значимое увеличение уровней НSР47 и Р4НА1. Репрезентативные изображения иммуноблоттинга можно видеть на рис. 4.

Параллельно оценивалось влияние ЕС-I на дифференциацию фибробластов. Воздействие ЕС-I привело к заметной перестройке цитоскелета в обработанных клетках с образованием четко расположенного актина, в то время как контрольные клетки обнаруживали довольно нерегулярный паттерн волокон. Более того, клетки, обработанные ЕС-I, казались больше и имели удлиненную форму.

С целью дальнейшего изучения влияния ЕС-I на морфологию фибробластов был проведен анализ NIH 3Т3 с помощью сканирующей электронной микроскопии, который показал, что клетки, обработанные ЕС-I, имели шероховатую поверхность с многочисленными отслаивающимися микровезикулами из клеточной мембраны. Эффект был довольно ранним, он был заметен уже через 4 часа обработки и усиливался с увеличением времени инкубации. Фактически, ультраструктуры мембран стали намного более многочисленными через 24 часа, почти полностью покрывая тело клетки. В то же время в необработанных клетках мембрана оставалась более гладкой, что типично для неактивированных клеток (Рис. 5).

Насколько известно, это было первое исследование клеточных эффектов водного раствора гетерологичного коллагена I типа. В настоящее время этот продукт используется в медицине не только для наружного применения (заживление ран, трофических язв, ожогов), но и для инъекционного введения с целью омоложения кожи в качестве адьюванта при биоревитализации кожи, способствуя регенерации соединительной ткани дермы и создавая оптимальные условия для физиологического неосинтеза коллагена. Результаты исследования подтверждают, что модели in vitro являются полезным инструментом для оценки будущих клинических возможностей суспензии коллагена и понимания молекулярных сигнальных путей, которые могут быть задействованы в эффектах, наблюдаемых после лечения коллагеном in vivo.

Литература

1. Потехина Ю. П. Структура и функции коллагена. Непрерывное медицинское образование, 2016:87;
2. Francesca Lombardi , Paola Palumbo , Francesca Rosaria Augello , Ilaria Giusti , Vincenza Dolo , Luca Guerrini , Maria Grazia Cifone, Maurizio Giuliani , «Type I Collagen Suspension Induces Neocollagenesis and Myodifferentiation in Fibroblasts In Vitro», 2020;
3. D. Choi, C. T. Sung, M. L. Juhasz, and N. A. Mesinkovsk,“Oral collagen supplementation: a systematic review of dermatological applications,” Journal of Drugs in Dermatology, vol. 18, no. 1, pp. 9–16, 2019;
4. L. J. Gould, “Topical collagen-based biomaterials for chronic wounds: rationale and clinical application,” Advances in Wound Care, vol. 5, no. 1, pp. 19–31, 2016;
5. D. U. Kim, H. C. Chung, J. Choi, Y. Sakai, and B. Y. Lee, “Oral intake of low-molecular-weight collagen peptide improves hydration, elasticity, and wrinkling in human skin: a randomized, double-blind, placebocontrolled study,” Nutrients, vol. 10, no. 7, p. 826, 2018;
6. D. Vollmer, V. West, and E. Lephart, “Enhancing skin health: by oral administration of natural compounds and minerals with implications to the dermal microbiome,” International Journal of Molecular Sciences, vol. 19, no. 10, p. 3059, 2018;
7. R. Parenteau-Bareil, R. Gauvin, and F. Berthod, “Collagenbased biomaterials for tissue engineering applications,” Materials, vol. 3, no. 3, pp. 1863–1887, 2010;
8. M. Meyer, “Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties,” BioMedical Engineering OnLine, vol. 18, no. 1, p. 24, 2019;
9. J. Lei, L. B. Priddy, J. J. Lim, M. Massee, and T. J. Koob, “Identification of extracellular matrix components and biological factors in micronized dehydrated human amnion/chorion membrane,” Advances in Wound Care, vol. 6, no. 2, pp. 43–53, 2017;
10. K. R. Vandana, Y. Prasanna Raju, V. Harini Chowdary, M. Sushma, and N. Vijay Kumar, “An overview on in situ micronization technique – an emerging novel concept in advanced drug delivery,” Saudi Pharmaceutical Journal, vol. 22, no. 4, pp. 283–289, 2014;
11. M. D. Shoulders and R. T. Raines, “Collagen structure and stability,” Annual Review of Biochemistry, vol. 78, no. 1, pp. 929–958, 2009.