Цель исследования: оценка количества клеток крови в плазме, обогащенной тромбоцитами и получаемой путем центрифугирования, а также оценка динамики концентрации факторов роста в тромбоцитарной плазме пациентов при хранении ее в жидком виде при температуре +4 0 С и +25 0 С вплоть до 10 дней

Автор: Гильманов Александр Жанович

Заведующий кафедрой лабораторной диагностики ИДПО, д.м.н., профессор, Вице-президент Федерации лабораторной медицины РФ. Вице-президент Российской ассоциации меди[1]цинской лабораторной диагностики (РАМЛД)

ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа, Россия

В лечебной практике, в частности косметологической, достаточно широко применяются методы лечения с использованием аутологичной плазмы. Эффективность метода связана с многочисленными биологически активными веществами, содержащимися в плазме, которые способствуют регенерации клеток и тканей, заживлению ран, купированию воспалительных процессов и т.д. Однако метод нельзя считать стандартизованным, поскольку количество тромбоцитов и иных клеток крови в аутоплазме, а также концентрация ростовых факторов и других биологически активных веществ сильно зависят от метода получения и условий хранения и могут варьировать в широких пределах. Целью настоящего исследования была оценка количества кровяных клеток в плазме, получаемой путем центрифугирования, и динамики уровня васкулоэндотелиального фактора роста VEGF при хранении такой плазмы в различных температурных условиях. Согласно полученным результатам, у здоровых доноров количество тромбоцитов в плазме после центрифугирования в гелевых гепарин-содержащих вакуумных пробирках сильно варьировало (от 10х109/л до 139х109/л) и практически не зависело от исходного содержания клеток в крови; количество лейкоцитов составляло (0,1-0,5)х 109/л, эритроциты отсутствовали. Уровень VEGF в разных пробах плазмы также существенно различался (от 13,7 до 87,5 мМЕ/мл, в среднем 45,1 мМЕ/мл), коррелируя с исходным числом тромбоцитов в крови. Хранение плазмы сопровождалось заметным возрастанием в ней уровня VEGF, причем степень роста была выше, если плазма хранилась при комнатной температуре (+22-+25 0 С) по сравнению с охлажденными до +4 0 С или замороженными до -20 0 С пробами плазмы. Причиной наблюдаемых изменений может быть способность некоторых клеток крови, остающихся в плазме после центрифугирования (в основном тромбоцитов), сохранять жизнеспособность и вырабатывать VEGF в течение достаточно длительного времени.

Введение

Терапия тромбоцитарной аутоплазмой представляет собой метод, включающий забор крови у пациента, выделение плазмы с сохранением в ней тромбоцитов, и последующее ее введение в патологический очаг. При этом из альфа-гранул активированных тромбоцитов в физиологически значимых соотношениях высвобождается ряд цитокинов и ростовых факторов, которые имеют важное значение для привлечения (рекрутинга) клеток и регенерации тканей: факторы роста тромбоцитов (PDGF и PDGF-BB), трансформирующий фактор роста–бета (TGF-β и β1), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), факторы роста фибробластов (FGF-1 и 2/bFGF), фактор роста эпидермиса (EGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) и т. д. [1-7]. Было подтверждено, что тромбоплазма содержит противовоспалительные медиаторы, известные как липоксины, которые способствуют купированию реакций воспаления [1]. Кроме того, тромбоплазма содержит определенное количество мононуклеарных клеток, что более благоприятно для заживления тканей по сравнению с клетками острого воспаления.

В настоящее время плазмотерапия используется в клинике в основном для стимуляции роста и регенерации тканей. Показано, что она эффективна для ускорения заживления костно-хрящевых дефектов [2,7,8], поврежденных сухожилий и связок [2, 6-11] и плохо заживающих кожных ран [3,7,8]. Разрабатываются специальные среды [13] и устройства [12] для длительного использования однократно полученной аутоплазмы пациента, рассматриваются различные способы достижения высокого кумулятивного эффекта от использования различных форм аутоплазмы [14].

Тромбоциты, содержащие факторы роста и другие биологически активные вещества, играют существенную роль в миграции, пролиферации, дифференцировке клеток и ангиогенезе — важнейших компонентах процесса регенерации тканей. Концентраты аутологичных тромбоцитов, содержащие повышенные уровни факторов роста, могут применяться во многих сферах медицины. Так, в области дерматологии и косметологии использование богатой тромбоцитами плазмы способствует ремоделированию тканей в коже и может использоваться в качестве адъювантной терапии при применении лазеров.

Эффективность концентрата тромбоцитов в со[1]действии заживлению ран и регенерации тканей находится в центре научных интересов исследовательских групп в течение последних десятилетий. С учетом современных достижений науки и более глубокого понимания биологии клеточных сигналов и факторов роста, исследователи начали использовать тромбоплазму в качестве нового метода лечения для ускорения регенерации поврежденных тканей, включая печень, кости, хрящи, сухожилия и пульпу зуба [15].

Концентраты аутологичных тромбоцитов полу[1]чают путем центрифугирования венозной крови в различных режимах с использованием или без использования тромбина или антикоагулянтов. В результате получается плазма крови, либо в крови формируется фибриновый сгусток, содержащий тромбоциты и лейкоциты [1]. Основными поколениями тромбоцитарных препаратов являются обогащенный тромбоцитами фибрин (PRF), концентрированный фактор роста (CGF) и тромбоцитарная нормоплазма.

Очевидно, что эффективность препаратов находится в прямой зависимости от количества в них веществ, обладающих стимулирующими свойствами. Между тем, количество ростовых факторов, содержащихся в используемых препаратах регенеративного действия, значительно различается. Процедура получения PRF и CGF сопровождается значительно большим накоплением некоторых факторов роста (в частности, bFGF) по сравнению с выделением PRP, при этом уровни других ростовых факторов в разных препаратах существенно не различаются [2].

Поскольку терапия аутологичной плазмой используется при лечении длительно не заживающих ран, в том числе и у маломобильных пациентов, она предполагает использование препаратов аутоплазмы вне условий клинки [13]. При этом отсроченное применение препаратов полученной ранее аутоплазмы предполагает сохранение в них активности основных факторов роста, что представляется весьма важным в отношении продолжительности действия стимулирующих факторов при хронических и вялотекущих дистрофических процессах в тканях. В научной печати нам встретилось очень небольшое количество источников, в которых оценивалась сохранность и/или динамика концентрации ростовых факторов в плазме, хранящейся в разных условиях. Так, сообщалось о возрастании концентрации эндотелиального фактора роста (EGF) в тромбоцитарной плазме, инкубированной при +4 0 С в течение 16 часов [15]. Очевидно, что дальнейшее проведение подобных исследований будет содействовать стандартизации технологических процессов получения и применения аутоплазмы, что позволит повысить эффективность препаратов и получать более предсказуемые результаты в различных клинических случаях.

Целью настоящего исследования была оценка количества клеток крови в плазме, обогащенной тромбоцитами и получаемой путем центрифугирования, а также оценка динамики концентрации факторов роста в тромбоцитарной плазме пациентов при хранении ее в жидком виде при температуре +4 0 С и +25 0 С вплоть до 10 дней. Для исследования был выбран васкулоэндотелиальный фактор роста VEGF ввиду его выраженного влияния на заживление ран, стимуляцию васкулогенеза и оксигенацию тканей.

Для получения тромбоцитарной аутоплазмы использовался набор для получения и введения аутологичной плазмы Medical Case Plasmoactive компании «Медикал Кейс» (регистрационное удостоверение от 14.05.2021 № РЗН 2021/14335). Согласно рекомендуемому производителем протоколу, кровь из кубитальной вены в объеме 8 мл забиралась в пробирки с натриевой солью гепарина и разделительным гелем. Центрифугирование для получения аутологичной плазмы осуществлялось в центрифуге EBA 200 (Hettich AG, Германия) при 3200 об/мин в течении 5 мин. Для определения эффективности разделения компонентов крови исходная цельная кровь и надосадочная плазма исследовались на автоматическом гематологическом 5-diff анализаторе SYSMEX XP-300 (Япония); сравнивалось количество клеток до и после центрифугирования. В пробах тромбоцитарной аутоплазмы на 1-е, 2-е, 5-е и 10-е сутки хранения как при комнатной температуре, так и при охлаждении до +4 0 С определялась концентрация васкулоэндотелиального фактора роста методом ИФА с использованием тест-наборов VEGF-ИФА-БЕСТ фирмы Вектор-Бест (Новосибирск, РФ). Произведено две серии исследований проб венозной крови, взятой у восьми здоровых добровольцев разного пола (2 мужчин и 6 женщин), и полученной из нее тромбоцитарной плазмы. Полученные данные обрабатывались методами непараметрической статистики с вычислением групповых медиан и квартилей, а также коэффициента корреляции по Спирмену.

Результаты

Показатели эффективности центрифужного разделения клеток крови (эритроцитарное и тромбоцитарное звенья) приведены в табл. 1, клеток лейкоцитарного ряда — в табл. 2. При анализе гематологических данных можно отметить, что при строгом соблюдении преаналитических правил, относящихся к взятию, обработке и хранению биоматериала (это важно!), центрифугирование крови «уводит» практически все эритроциты (99,9%), гемоглобин (99,3%) и большую часть лейкоцитов (96,6%) под гелевый слой в пробирках. В надосадочной плазме остается небольшая часть «малых» лейкоцитов (80,0% — лимфоциты), а также несколько увеличивается доля моноцитов по сравнению с исходной кровью (с 9,3 до 9,9 %).

Количество тромбоцитов в плазме в результате центрифугирования снижается в разной степени – от -45,5% до -96,3% (медианное значение -83,5%). Уменьшается средний объем тромбоцита (MPV, с 8,8 до 6,1 фл — на 31,4%), что может быть связано с изменением осмотического окружения клеток, особенностями проницаемости клеточных мембран и плотности тромбоцитов. Исходное количество тромбоцитов в пробах крови составляло (243–308)х 109/л (в среднем 269,3±24,2х109/л), что соответствует референтным значениям для здоровых людей. Остаточное количество тромбоцитов в плазме после центрифугирования варьировало от 10х109/л до 139х109/л (в среднем 55,0±40,8х109/л); зависимость остаточного количества тромбоцитов в плазме от исходного количества тромбоцитов и лейкоцитов в крови практически отсутствовала (r =0,17– 0,20).

В целом отмечался значительный разброс изучаемых показателей (CV = 63,6 – 315,8%), возможными причинами которого могли быть: популяционная вариация, различное состояние организма доноров, неполное соблюдение технологий взятия, обработки и хранения биоматериала (не всегда адекватное перемешивание содержимого пробирок сразу после взятия, качество самих пробирок, гепарина и геля в них, режимы хранения и центрифугирования, условия транспортировки) и другие трудноучитываемые факторы.

Содержание VEGF и его изменения при хранении проб плазмы в разных температурных условиях приведены в табл. 3.

С аналитических позиций определение уровня VEGF было достаточно корректным — калибровочные графики в разные сроки исследования практически совпадали, параметры контрольной сыворотки, входящей в состав наборов, во всех случаях укладывались в допустимый диапазон.

В день взятия крови у различных здоровых доноров концентрация VEGF в плазме существенно различалась и составляла 13,7 – 87,5 мМЕ/мл (в среднем 45,1 мМЕ/мл), коэффициент вариации CV=74,0%. Полученные данные могут служить определенным ориентиром для аналогичных исследований, поскольку VEGF не является рутинным лабораторным аналитом, референтные интервалы для него не разработаны и могут отличаться при использовании различных тест-наборов и аналитических систем. Отмечалась корреляционная связь средней силы между уровнем VEGF и содержанием в исходной крови тромбоцитов (r=+0,45) и лейкоцитов (r=+0,27); корреляции VEGF с количеством клеток в плазме после центрифугирования не было (r < 0,07).

На второй день после взятия крови концентрация VEGF в пробах плазмы, хранившихся при комнатной температуре, снизилась в среднем на 21,1%, а при хранении при +4 о С — возросла в среднем на 22,7%. При этом уровень аналита в разных пробах значительно варьировал (CV= 94,0% и 65,3% соответственно), и изменения за первые сутки хранения были разнонаправленны (от -61,6% до +136,8%). Корреляция уровня VEGF была значимой лишь с количеством тромбоцитов (r= +0,62 для хранения при комнатной температуре и +0,23 при охлаждении) и с количеством лейкоцитов в исходной крови (r= +0,21 и +0,50). Причины этого явления не совсем понятны; можно предположить, что уровень VEGF при краткосрочном хранении плазмы в разных температурных условиях определяется разными клетками. Однако, как и в день взятия, корреляции VEGF с количеством клеток в плазме после центрифугирования не было (r < 0,05).

На 5 день после взятия крови в образцах плазмы, хранящихся при комнатной температуре (+25 о С), уровень VEGF вырос в среднем на 35,1% по сравнению с 1-м днем. В охлажденных пробах (+4 о С) прирост уровня ростового фактора был меньшим — на 9,2%, что свидетельствует о распаде части VEGF между 2 и 5 сутками хранения. По-прежнему отмечалась значительная вариация уровня аналита (CV= 85,8% и 75,9%); изменения его концентрации по отношению к 1-му дню составили от +237,9% до -66,8%. Сохранялась корреляция VEGF с исходным уровнем тромбоцитов (r= +0,59) и лейкоцитов (r= +0,33) во взятой крови до центрифугирования, но лишь при хранении плазмы при +25 о С. Возрастание концентрации VEGF на 5-й день хранения при комнатной температуре после некоторого снижения на 2-е сутки труднообъяснимо; вероятно, его продуцировали активированные остаточные клетки (лейкоциты, тромбоциты), или он являлся продуктом ограниченного протеолиза каких-либо плазменных белков.

На 10 день хранения плазмы при комнатной температуре уровень VEGF парадоксально продолжал расти, достигнув 186,6% от уровня на 1-й день. В то же время в пробах, хранившихся при +4 о С, содержание VEGF было повышено в среднем лишь на 10,2% от исходного. Уровень аналита значительно варьировал (CV= 79,1% и 73,6%); изменения концентрации за все время хранения составило от +398,9% до -80,3%. Сохранялась положительная корреляция средней силы концентрации VEGF в плазме с уровнем тромбоцитов (r=+0,49) и лейкоцитов (r=+0,43) в исходной крови, но не в полученной PRP.

Представляло интерес определение уровня VEGF в «консервированных» пробах плазмы, подвергшихся замораживанию при -20 о С сразу после получения и оттаянных на 10-й день эксперимента. Согласно полученным нами данным, хранение PRP в замороженном виде оказалось предпочтительнее охлаждения: в замороженных-оттаянных пробах концентрация VEGF была выше исходной в среднем на 47,0% (CV=63,6%), что труднообъяснимо, но может быть связано со стимуляцией остаточных клеток в плазме во время центрифугирования и после оттаивания. Однако по величине прироста VEGF замораживание плазмы проигрывало ее хранению при комнатной температуре.

И в заключение

По-видимому, некоторые клетки крови, оставшиеся в плазме после центрифугирования, сохраняют жизнеспособность и возможность выработки VEGF в течение достаточно длительного времени. В условиях хранения при комнатной температуре их активность после первоначального «шокового» снижения на 2-й день эксперимента в последующие сроки возрастает, что сопровождается заметным накоплением VEGF в плазме. Уровень ростового фактора при хранении охлажденной до +4 о С плазмы также постепенно возрастал, но в гораздо меньшей степени, что может объясняться снижением метаболической и белковосинтетической активности остаточных клеток в плазме и/или распадом части синтезированного VEGF. В пользу предположения о синтезе дополнительных количеств VEGF остаточными клетками говорит положительная корреляция между уровнем VEGF при хранении плазмы при комнатной температуре и исходным содержанием тромбоцитов и лейкоцитов в крови (но не в плазме после центрифугирования).

Таким образом, исследованный биоматериал с учетом количества клеток и способности к сохранению и дополнительной продукции VEGF можно считать активной тромбоцит-содержащей плазмой. При необходимости сохранения свойств плазму можно замораживать (при этом возможен распад части остаточных клеток), либо хранить при охлаждении до +4 о С в течение 1-2-5 дней. Хранение плазмы при комнатной температуре сопровождается существенным ростом уровня VEGF и связанной с ним потенциальной регенераторной активности, но при этом в пробах возможны нежелательные явления (например, рост микроорганизмов). Механизм повышения концентрации VEGF в плазме при хранении требует специального изучения.

Литература

1. Еl-Sharkawy H, Kantarci A, Deady J, Hasturk H, Liu H, Alshahat M, et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties. J Periodontol 2007; 78(4): 661–9;
2. Foster TE, Puskas BL, Mandelbaum BR, Gerhardt MB, Rodeo SA. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am J Sports Med 2009;37(11):2259–72;
3. Rozman P, Bolta Z. Use of platelet growth factors in treating wounds and soft-tissue injuries. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat 2007;16(4):156–65;
4. Everts PA, Knape JT, Weibrich G, et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: a review. J Extra Corpor Technol 2006;38(2):174–87;
5. Sanchez M, Anitua E, Orive G, Mujika I, Andia I. Platelet-rich therapies in the treatment of orthopaedic sport injuries. Sports Med. 2009;39(5):345–54;
6. Creaney L, Hamilton B. Growth factor delivery methods in the management of sports injuries: the state of play. Br J Sports Med. 2008;42:314–20;
7. Alsousou J, Thompson M, Hulley P, Noble A, Willett K. The biology of platelet-rich plasma and its application in trauma and orthopaedic surgery: a review of the literature. J Bone Joint Surg Br 2009;91(8):987–96;
8. Anitua E, Sanchez M, Orive G, Andia I. Delivering growth factors for therapeutics. Trends Pharmacol Sci 2008; 29(1):37–41;
9. Lyras DN, Kazakos K, Verettas D, et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 2009;129(11):1577–82;
10. Murray MM, Spindler KP, Abreu E, et al. Collagen-platelet rich plasma hydrogel enhances primary repair of the porcine anterior cruciate ligament. J Orthop Res 2007;25:81–91;
11. Mishra A, Pavelko T. Treatment of chronic elbow tendinosis with buffered platelet-rich plasma. Am J Sports Med 2006;34(11):1774–8;
12. Antonino Araco. A prospective study comparing topic platelet-rich plasma vs. placebo on reducing superficial perioral wrinkles and restore dermal matrix. J Cosmet Laser Ther. 2019;21(6):309-315;
13. Scott A. Sell, Jeffery J. Ericksen, et al. A case report on the use of sustained release platelet-rich plasma for the treatment of chronic pressure ulcers. J Spinal Cord Med. 2011 Jan;34(1):122–127;
14. Nagwa Ali Fahmy Diab, Al-shimaa M. Ibrahim, Aya Mohamed Abdallah. Fluid Platelet-Rich Fibrin (PRF) Versus Platelet-Rich Plasma (PRP) in the Treatment of Atrophic Acne Scars: A Comparative Study. Arch Dermatol Res. 2023; 315(5):1249–1255;
15. J Xu, L Gou, P Zhang, H Li, S Qi. Platelet‐rich plasma and regenerative dentistry. Aust Dent J. 2020 Jun; 65(2): 131–142.