ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Репринт. Статья опубликована в журнале «Хирургическая практика», №2/2017
Оразов Мекан Рахимбердыевич – д.мед.н., доцент кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии медицинского факультета, Медицинского института Российского университета дружбы народов; отрасль специализации – акушерство и гинекология; пластическая хирургия.
Сулаева Оксана Николаевна – д.мед.н., профессор, заведующая отделом патологии Украинского научно-практического центра эндокринной хирургии, отрасль специализации – патологическая анатомия; патологическая физиология.
Старкова Елена Юрьевна – пластический хирург, председатель Европейской Школы Тредлифтинга, медицинский советник компании Beauty Expert, врач-дерматолог, врач-косметолог, тренер методист международного класса, врач-исследователь Института инновационного развития и экспертизы.
Статья посвящена изучению клеточных и молекулярных механизмов стимуляции кожи после имплантации нитей на основе полидиоксанона.
Цель исследования: анализ влияния нитей на основе полидиоксанона, на процессы биореструктуризации дермы.
Дизайн: проспективное, независимое, плацебо-контролируемое исследование.
Материалы и методы: Проведено проспективное, независимое, плацебо-контролируемое клинико-морфологическое исследование в период 2015-2017 гг, в которое на условиях добровольного информированного согласия были включены 22 пациента (возраст 35 50 лет) с возраст ассоциированными изменениями кожи. Для оценки механизмов влияния нитей на основе полидиоксанона на ремоделирование дермы проведено общеморфологическое исследование биоптатов кожи при окраске гематоксилином и эозином, а также по методу ван Гизон. Для оценки характера межклеточных коопераций различные линии клеток визуализировали методом иммуногистохимии (ИГХ).
Результаты исследования показали, что в основе морфогенетической перестройки кожи после имплантации нитей на основе полидиоксанона лежит активация механизмов репарации. Данный процесс проявляется стимуляцией экспрессии VEGF, активацией ангиогенеза и реорганизацией сосудистого русла кожи. Кроме того, отмечен стимулирующий эффект нитей на основе полидиоксанона на клетки фибробластического ряда через активацию стромальной васкулярной фракции с последующим усилением продукции компонентов матрикса дермы. Следует отметить, что помимо активации неоколлагеногенеза, ведущей к реструктуризации дермы и эпидермиса, введение нитей на основе полидиоксанона оказывает позитивное влияние на баланс ММР/ТИМР, ограничивая механизмы деградации и способствуя накоплению матрикса соединительной ткани дермы.
Вывод: Таким образом, вышеизложенные результаты исследования позволяют сделать вывод о том, что нитевая имплантация с использованием нитей на основе полидиоксанона оказывает плейотропный стимулирующий эффект на дерму.
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Увеличение средней продолжительности жизни в развитых странах определило приоритетное развитие эстетической медицины, одним из направлений которой является предотвращение и коррекция возрастных изменений области лица и шеи.
Как известно, возрастные изменения лица и шеи включают комплекс проявлений, в том числе изменение пигментации кожи, появление складок, линий и морщин, утрату объема тканей, и как следствие – птоз, предопределяющие изменение размеров, 3D-вида и пропорций лица [1]. В основе этих возрастных проявлений лежит комплекс изменений всех структур лица, включая кожу, подкожную жировую клетчатку, мышцы лица, поверхностные и глубокие фасции, а также скелет лицевой части черепа[2].
Однако ключевое значение в формировании эстетических проблем, связанных со старением, конечно играют возрастные изменения кожи.
Гистологические изменения включают изменения во всех слоях кожи. В первую очередь это отражается на структуре эпидермиса, толщина которого уменьшается за счет ограничения пролиферации кератиноцитов. Кроме того, заметно сглаживается эпидермо-дермальная граница вследствие уменьшения размеров сосочков и выраженности сосочкового слоя дермы в целом, что ассоциировано с дезорганизацией микроциркуляторного русла, предопределяющей ограничение трофики эпидермиса и детерминирующей его прогрессирующие изменения [3, 4]. Значимые изменения происходят и в самой дерме. Одним из ключевых событий, обусловливающих старение кожи, ее дряблость и снижение механической прочности, является снижение синтеза компонентов матрикса дермы [4, 5].
Одним из способов коррекции возрастных изменений кожи является применение нитевого лифтинга. На сегодняшний день научная литература располагает рядом убедительных доказательств эффективности и безопасности технологии нитевого лифтинга [6, 7]. Ключевым вектором развития данного метода стал переход от нерассасывающихся нитей из полипропилена к биосовместимым абсорбируемым материалам. Это привело к разработке и внедрению нитей на основе поли-L-молочной кислоты и полидиоксанона. Полидиоксанон (ПДО) – прочный синтетический монофиламентный материал, абсорбируемый в течение 4-6 месяцев (в зависимости от толщины). Они прочные, гибкие, упругие, гидрофобные. Разрушение полидиоксанона происходит путем гидролиза с образованием СО2. ПДО-нити биосовместимы, не обладают антигенными и пирогенными свойствами, что во многом определяет безопасность их применения (нити утверждены к использованию FDA) [8, 9].
При этом следует отметить, что большинство исследований эффективности нитевой имплантации базируются на данных оценки удовлетворенности пациентов и субъективной оценки независимыми экспертами. Показано, что при абсорбции ПДО нити вызывают биореструктуризацию кожи, обеспечивая умеренный стимулирующий эффект и способствуя улучшению визуальных характеристик кожи. Однако за рамками исследований остаются патогенетические механизмы, объясняющие реструктуризирующий эффект ПДО-нитей. На сегодня данные эффекты связывают исключительно с усилением продукции коллагена. Однако количество коллагена в дерме зависит от ряда факторов, включая количество фибробластов, их секреторную активность, скорость энзиматической деградации матрикса. Последняя во многом ассоциирована с воспалением и количеством лейкоцитов, рекрутированных в дерму при повреждении введением нитей. Кроме того, как мы знаем, характеристики кожи во многом определяются условиями ее трофики – количеством и проницаемостью сосудов. В данном аспекте механизмы биостимулирующих эффектов нитей на основе полидиоксанона являются практически неизученными.
Целью данной работы стал морфологический анализ влияния нитей на основе полидиоксанона на процессы биореструктуризации дермы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведено проспективное, независимое, плацебо-контролируемое клиническое исследование в период 2015-2017 гг, в которое на условиях добровольного информированного согласия были включены 22 пациентки с возраст ассоциированными изменениями кожи, в возрасте от 35 до 50 лет. Панч-биопсию проводили до и через 2 недели,1,5 и 3 месяцев после имплантации нитей на основе полидиоксанона. Основную группу составили биоптаты, полученные из переднебоковой поверхности живота после имплантации нитей на основе полидиоксанона (ПДО) Lead Fine Lift с использованием иглы проводника. Для морфологического контроля использовали анализ результатов панч-биопсии у тех же пациенток, из аналогичных зон с контрлатеральной стороны, который выполняли путем введения иглы проводника на аналогичную глубину и на протяженность без нитей с использованием в качестве плацебо физиологического раствора. Общеморфологическое исследование проводили при окраске гематоксилином и эозином. Для визуализации волокон матрикса использовали гистохимическое окрашивание биоптатов по методу ван Гизон.
Для оценки характера межклеточных коопераций различные линии клеток визуализировали при помощи иммуногистохимии (ИГХ) с использованием моноклональных антител к СD68, CD31, CD105, VEG, α-SMA, MMP1, ММР9 и TIMP1. С целью объективизации морфологического исследования использовали комплексный морфометрический анализ, который проводили с помощью специального программного обеспечения ImageTool version 3.0. и графического редактора Adobe Photoshop CS4 Extended v.11.0.1. Снимки выполняли на микроскопе Olympus BX51 с цифровой камерой DP70 (Olympus, Япония).
Результаты исследования и их обсуждение: Анализ морфологии кожи, полученной путем панч-биопсии у пациентов с возрастными изменениями кожи до имплантации нитей на основе ПДО, продемонстрировал наличие типичных признаков старения. Помимо сглаженности эпидермо-дермальной границы и слабого развития сосочкового слоя дермы, обращали на себя внимание неравномерное кровенаполнение сосудов поверхностного и глубокого дермального сплетения, снижение количества фибробластов. Межклеточное вещество дермы характеризовалось снижением плотности коллагеновых волокон, их дезорганизацией, явлениями эластолиза. Эти явления были сопряжены с дисбалансом экспрессии ММР1 и ММР9 с одной стороны и ТІМР1 с другой, что соответствует данным литературы, констатирующим превалирование деградации матрикса над синтетическими процессами [10, 11]. В дерме определялась умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация – преимущественно в периваскулярном регионе, отражающая провоспалительные изменения в коже с возрастными изменениями.
Анализ морфологии кожи через 2 недели после введения ПДО-нитей в сравнении с группой плацебо выявил ряд интересных фактов, отражающих реакцию кожи на повреждение вследствие пенетрации тканей и на сам имплантируемый материал.
При анализе и интерпретации морфологических изменений в коже мы исходили из следующих известных фактов:
1) кожа представлена обновляющимися тканями с резервом стволовых клеток и высокой способностью к регенерации;
2) повреждение кожи запускает стереотипную морфогенетическую программу, аналогичную заживлению ран;
3) учитывая классическую хронологию процесса заживления, через 14 суток после повреждения имеет место завершение фазы репарации с последующей активацией ремоделирования дермы. По факту, в биоптатах основной группы было выявлено увеличение плотности расположения клеток сосочкового и сетчатого слоев дермы. Этот феномен был в первую очередь связан с перестройкой сосудистого русла кожи. В сосочковом слое дермы было отмечено увеличение плотности капилляров и умеренный интерстициальный отек. Последнее сопровождалось явлениями вакуолизации кератиноцитов. Хотя параллельно этому отмечалось увеличение площади эпидермдермального соединения и плотности клеток в базальном слое эпидермиса, опосредованно отражающее усиление пролиферативных процессов. Аналогичная сосудистая реакция был выявлена и в глубоких отделах дермы. При этом вдоль сосудов поверхностного сосудистого сплетения и вокруг сосудов глубокого сосудистого сплетения отмечалось увеличение плотности клеток за счет умеренной инфильтрации.
Иммуногистохимический анализ выявил, что перестройка сосудистого русла в поверхностном и глубоком слоях дермы была связана с увеличением количества CD68-позитивных клеток, то есть макрофагов, более, чем в 3 раза (p<0,001). Последние у пациентов после имплантации ПДО-нитями превалировали в периваскулярном регионе (рис. 1), и в отличии такового в группе сравнения, редко встречались в свободном виде в сетчатом слое дермы.
Параллельно этому в дерме определялось увеличение количества эндотелиоцитов (CD31+ клеток; p<0,01). Причем развитие данной реакции было напрямую ассоциировано с повышением количества CD105+ активного эндотелия на 137% (p<0,001) и усилением экспрессии VEGF (рис. 2). Характерно, что источником ангиогенных сигналов при введении ПДО-нитей, был как эпидермис кожи, так и клетки периваскулярной зоны дермы.
Выявленная ассоциация между клеточной реакцией в периваскулярном компартменте за счет макрофагов и стимуляцией ангиогенеза, по сути, означает 2 факта: вероятно, увеличение количества макрофагов в дерме кожи через 14 суток происходит за счет М2-фенотипа макрофагов; макрофаги принимают участие в перестройке сосудистого русла кожи при тредлифтинге ПДО-нитями, являясь одним из источников продукции VEGF, стимулирующего ангиогенез.
Параллельно активации ангиогенеза было отмечено увеличение количества клеток, ответственных за репарацию дермы – миофибробластов (p<0,001), которые определялись в виде свободных клеток, а также клеток, ассоциированны с сосудами микроциркуляторного русла дермы. Предполагается, что основным источником формирования репаративного пула клеток фибробластического ряда являются собственные дермальные предшественники, а именно – перициты. Вероятно, реструктуризация дермы при имплантации нитями на основе ПДО происходит за счет мобилизации собственных резервов кожи вследствие стимуляции стромальной васкулярной фракции предшественников.
Изучение морфологии кожи в панч-биоптатах через 1,5 и 3 мес после имплантации ПДО нитями показало наличие комплекса изменений, характеризующегося реструктуризацией как эпидермиса, так и дермы кожи. В эпидермисе отмечалось увеличение толщины за счет шиповатого слоя, углубление сосочков и гребешков, определяющее увеличение эпидермо-дермальной границы. Эти изменения были связаны с морфогенезом сосочкового слоя дермы, в котором отмечено увеличение плотности сосудов микроциркуляторного русла. Ситуация была противоположной в группе сравнения, где через 1,5 и 3 мес после введения плацебо активация эндотелия практически полностью нивелировалась.
Параллельно перестройке сосудистого русла дермы, отмечались признаки продолжающегося ремоделирования дермы. Об этом свидетельствовало сохранение реакции миофибробластов, хотя количество макрофагов существенно снижалось по сравнению с предыдущим сроком исследования (Р<0,05), хотя по-прежнему было выше исходного уровня.
Между тем, следует отметить сохранение экспрессии VEGF как в клетках эпидермиса, так в и клетках дермы. При этом распределение экспрессии данного фактора роста через 1,5 мес после имплантации отличалась от пространственного паттерна макрофагов и миофибробластов. α-SMA-иммунопозитивные клетки обнаруживались как в сосочковом, так и в сетчатом слое дермы, и по морфологическим характеристикам соответствовали фенотипу клеток фибробластического ряда. Это может свидетельствовать о роли миофибробластов в регуляции перестройки сосудистого русла кожи после нитевой имплантации.
Суммарный анализ клеточных популяций дермы через 1,5 и 3 мес после нитевой имплантации выявил позитивную тенденцию в сторону сохранения численности клеток фибробластического ряда (показатель был в 2 раза выше, чем в группе сравнения) и ограничения пула макрофагов. Количество последних снизилось до 10,5±0,67 (95% ДИ 9,22-11,78), что было практически в 2 раза ниже показателя в предыдущий срок исследования (p<0,01). Такая смена клеточных популяций по сути отражает превалирование фазы репарации в дерме через 1,5 мес после введения ПДО нитей. Реорганизация сосудистого русла поверхностных и глубоких слоев дермы, а также реакция миофибробластов привели к существенной реструктуризации матрикса дермы, заметной уже через 1,5 мес после введения ПДО нитей и сохранялись и через 3 мес. Сосочковый слой дермы характеризовался увеличением плотности тонких коллагеновых волокон, организованных в упорядоченную сеть. В сетчатом слое максимальной перестройке были подвержены зоны вокруг введения нитей и в периваскулярных участках. Здесь на фоне сохранения толстых пучков коллагеновых волокон, появлялись зоны нежнофибриллярного матрикса, представленного сетью новообразованных коллагеновых волокон (рис. 4).
Такие структурные изменения матрикса были напрямую связаны с изменением характера контроля объема межклеточного вещества. Через 1,5 и 3 мес после введения ПДО-нитей отмечено умеренное ограничение экспрессии ММР-1 и ММР-9. При этом количество ММР-9 позитивных клеток снизилось на 34% по сравнению с предыдущим сроком исследования (p<0,05), хотя по-прежнему несколько превышало исходный показатель (на 10%). Такие клетки выявлялись исключительно в периваскулярном компартменте, что вероятно сопряжено с ролью данного фермента в ремоделировании сосудистого русла. Характерно, что при этом было обнаружено повышение экспрессии ТІМР-1 (p<0,01). Причем экспрессия тканевого ингибитора металлопротеиназ 1 носила универсальный характер и наблюдалась как в поверхностном, так и в глубоком слоях дермы. Важно также отметить, что в отличие от группы сравнения, экспрессия TIMP1 сохранялась не только через 1,5, но и через 3 мес после введения ПДО-нитей. Учитывая роль TIMP1 в накоплении матрикса, можно предположить, что именно изменение баланса ММР/TIMP1 при введении ПДО-нитей играет ведущую роль в реструктуризации межклеточного вещества дермы. Не менее важен и известный механизм активации экспрессии TIMP1. Как известно, активация данного ингибитора металлопротеиназ зависит от эффектов TGFβ. Последний является важнейшим фиброгеном, мишенями которого являются клетки фибробластического ряда, а также противовоспалительным агентом, ограничивающим активность лейкоцитов, макрофагов, также снижающим продукцию провоспалительных цитокинов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, использование нитей на основе ПДО при возраст-ассоциированных изменениях кожи оказывает выраженный стимулирующий эффект на дерму. Следует заключить, что данный эффект сопряжен с включением реакции нескольких клеточных линий, включая макрофаги, эндотелий и миофибробласты. Ключевое значение в перестройке кожи при этом имеет активация макрофагов с параллельным повышением экспрессии VEGF, активацией ангиогенеза, а также стимуляцией клеток фибробластического ряда за счет мобилизации стромальной васкулярной фракции. Вместе с тем, следует отметить, что помимо активации неоколлагеногенеза, ведущей к реструктуризации дермы и эпидермиса, введение ПДО нитей оказывает позитивное влияние на баланс ММР/ТIМР, ограничивая механизмы деградации и способствуя накоплению матрикса соединительной ткани дермы.